【凍干小課堂】常見的凍干保護劑

凍干保護劑的主要功用是降低冷凍和融化過程對脂質體的損害，研究較多的質體凍干保護劑有單糖、二糖、寡聚糖、多糖、多元醇及其他水溶性高分子物質等。各種保護劑的保護機制不盡相同，如甘露醇可增加黏度、降低水的結晶速率及內水相形成冰晶共熔點溫度;D-葡萄糖在凍結時可在水相的冰晶生長空隙濃縮并覆蓋在脂質體表面，使冰晶不能嵌入脂質體的雙分子層膜;而海藻酸是通過氫鍵與磷脂的極性基團結合來穩(wěn)定凍結時的脫水膜，有效取代了在極性基團周圍的殘余水分，還可增加空間效應，降低相變溫度。保護劑的用量一般為2%~5%(w/v)。凍干保護劑對脂質體的保護作用與其用量、凍干工藝、脂質體及藥物的性質等因素有關。

對于脂質體的凍干，一般用糖類物質作保護劑。糖類保護劑在凍結過程中主要在以下幾個方面對脂質體具有保護作用。

1、阻止融合

通過凍干保護劑減少囊泡與囊泡之間的接觸附著以阻止融合。隨著脂質體混懸液的凍結和冰晶的生長，保護劑逐漸濃縮，并分布在脂質體囊泡周圍,可作為間隔基質阻止囊泡之間的融合和藥物的泄漏。

2、抑制冰晶生長

保護劑可以抑制冰晶的生長,減小冰晶嵌入脂質體雙層膜的幾率，減少冰晶對脂質體囊泡的損傷，可防止膜破裂。

3、提高轉變溫度

保護劑可以提高脂質體混懸液的玻璃化轉變溫度、并在一定的降溫速率下，使脂質體混懸液實現(xiàn)部分玻璃化，避免了結晶，減少了由于冰晶生長而引起的各種損傷。

4、黏性增強

在脂質體混懸液凍結過程中，糖類保護劑使溶液的黏性增加，從而弱化了水的結晶過程，達到了保護的目的。

5、形成氫鍵

凍干保護劑可與脂質體磷脂的極性基團形成氫鍵，脫水后代替水作為脂質體的穩(wěn)定劑，保持脂質體膜的完整性，抑制藥物的滲漏，這種機制稱為“水替代假說"。在無凍干保護劑的情況下，凍干會使

凍干脂質體的相轉變溫度大幅提高，而加入糖類保護劑后，可在膜界面的極性區(qū)域代替失去的水，避免了Tm的這種劇烈變化。隨凍干條件的不同，Tm可高于或低于水化脂質體的相轉變溫度（Tc）。

糖與磷脂間的相互作用越強，Tm越低，保護作用就越強。Tm降低的程度與凍干品的穩(wěn)定性有較好的相關性。

概括地講，在脂質體的干燥過程中，保護劑需滿足兩個基本條件:

1、具有相當高的玻璃化轉變溫度Tg'，對此條件要求較高。

2、能夠與脂質雙分子層發(fā)生很好的相互作用?；旌媳Ｗo劑也需要滿足這個要求。如單獨使用葡萄糖或淀粉(HES)作保護劑凍干時，蛋磷脂脂質體不穩(wěn)定，但兩者聯(lián)合使用可獲得較好的凍干效果。

在凍干過程中，兩者分別發(fā)揮不同的作用，葡萄糖可與磷脂發(fā)生相互作用，而HES與脂質雙分子層不發(fā)生相互作用，但它提供了一個較高的Tg'。兩者混合使用亦可用于紅細胞的凍干。

常見的凍干保護劑

1、單糖

主要有葡萄糖、甘露糖、半乳糖及果糖等。葡萄糖對凍融過程中脂質體的形態(tài)、粒徑和包封率有較好的保護作用，但玻璃化轉變溫度(Tg')較低，單用時得到的凍干產(chǎn)品常出現(xiàn)明顯的藥物滲漏。甘露糖、

半乳糖及果糖等對脂質體的保護作用與葡萄糖類似。

2、二糖

二糖是研究最多也是有效的凍干保護劑，常用的有海藻糖、麥芽糖、蔗糖及乳糖。其中海藻糖為非還原性二糖，可在無水條件下保護生物膜功能、維持鈣離子的正常膜轉運，也可使脂質體在脫水時保持完整形態(tài)。其他二糖只有在大于生理濃度時才具有較好的脫水保護作用、Crowe等研究表明，棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿-磷脂酰絲氨酸(PS)脂質體直接凍干會引起大部分甚至全部水溶性藥物滲漏，但若在

凍干前分別在肪質體的內、外水相中加入適量海藻糖、則凍干品復水后藥物的保留率與(Retenton%)在95%以上。同時發(fā)現(xiàn)，抑制脂質體融合比抑制藥物滲漏所需的海藻糖濃度小得多(1/10以下)。

直接凍干也會引起蛋黃卵磷脂(EPC)脂質體的聚集和粒徑增大，用海藻糖作保護劑時，復水后脂質體的粒徑無顯著變化。海藻糖、麥芽糖及蔗糖對二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)脂質體的凍干保護作用相近、

復水后粒徑無顯著變化，水溶性藥物的保留率約90%，顯著優(yōu)葡萄糖、半乳糖和甘露糖。Van Winden 等分別采用海藻榶、蔗糖、乳糖及麥芽糖為保護劑制備多柔比星凍干脂質體，復水后粒徑無顯著變化，

藥物保留率均在90%以上。將蔗糖和脂肪酸以共價鍵結合制備脂肪酸蔗糖酯，考察了含有該膜材的EPC和氫化蛋黃卵磷脂脂質體在凍融和復水過程中的穩(wěn)定性。結果表明、單用脂肪酸蔗糖酯不能抑制羧基熒

光素的滲漏。若再加人5%蔗糖，復水后脂質體中羧基熒光素的保留率可達 95%。

3、寡聚糖

研究表明，葡萄糖對二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)和EPC脂質體中鈣黃綠素滲漏的保護作用較弱，單用時還會引起一定程度的脂質體聚集和融合，但對DPPC脂質體具有相對較高的保護作用，而麥芽糖和麥芽三

糖對EPC脂質體的護作用較高。類似研究表明，用麥芽三糖(maltotriose)作保護劑得到的凍干脂質體復水后藥物保留率可達90%，其他麥芽糖糊精(maltodextrins)的保護效果隨葡萄糖殘基數(shù)目的增大而降低。

Cycloinulohexaose(CF-6)能有效抑制凍干過程中脂質體的融合及藥物滲漏，復水后脂質體的粒徑分布無顯著變化，水溶性藥物的保留率可達 85%以上。若加入適量甘油、乙二醇、丙二醇、甘氨酸及脯氨酸等

更可增強其凍干保護能力，復水后藥物保留率可達90%，其機制可能附加劑的存在使脂質與CF-6間的氫鍵比增加有關。

4、多元醇

Tanaka 等研究了山梨醇、肌醇和甘露醇等多元醇對脂質體的凍干保護作用，結果表明多元醇的作用均比二糖差，凍干產(chǎn)品均有明顯的聚集。以肌醇和山梨醇為保護劑的凍干品復水后粒徑顯著增大，且藥物滲漏嚴重；

甘露醇體系中藥物幾乎全部滲漏。但甘露醇的低共熔溫度較高，常用作輔助保護劑以保持凍干品的良好外觀。

5、多種保護劑合用

聯(lián)合應用兩種或兩種以上的保護劑可獲得比單用時更好的效果。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、PEG、多糖、淀粉及纖維素衍生物等水溶性高分子物質也可與上述保護劑合用。將果聚糖或淀粉與葡萄糖合用，載水溶性

藥物的凍干EPC脂質體復水后的保留率可達85%以上。海藻糖單用時，凍干甲氨蝶呤鈉脂質體復水后保留率為63%，與PEG合用時可提高到70%以上。另外，硼酸鹽離子或無機磷酸鹽和海藻糖在干燥狀態(tài)下可形成復合物，從而提高海藻糖的Tg'。